Цель данного исследования — разработать метод немеченого однокристалльного обнаружения с помощью нанопоров для идентификации топологической структуры G-квадруплексов (G4). Сначала на примере параллельной последовательности G4 промотора сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) сравнивали эффективность обнаружения молекул G4 тремя нанопорами: белком поры Mycobacterium smegmatis (MspA), аэролизином (AeL) и альфа-гемолизином (HL), при этом альфа-гемолизин был выбран в качестве канала для дальнейших экспериментов. Затем были выбраны три представительных модели G4: параллельная 27-парная последовательность онкогена c-Myc (c-Myc27bp), антипараллельный тромбин-аптамер (TBA) и человеческая теломерная G4-последовательность (H24A), их топология была подтверждена методом циркулярного дихроизма (CD), после чего с помощью нанопора альфа-гемолизина проводилось различение на уровне одиночных молекул. Для решения проблемы длительного времени блокады и низкой пропускной способности c-Myc27bp в обеих его концах было добавлено по 25 аденинов для формирования c-Myc77bp с целью оптимизации прохода. Результаты показали, что нанопоры альфа-гемолизина эффективно различают одноцепочечную ДНК (ssAf17) и три различных топологических типа молекул G4; при этом оптимизированный c-Myc77bp вызывал характерные вторичные ступенчатые сигналы во время прохождения, что значительно повышало распознаваемость сигнала и пропускную способность. Эти результаты демонстрируют, что система однокристального сенсора на основе нанопоров альфа-гемолизина может применяться для немеченой идентификации топологии G4, предоставляя новую техническую стратегию для анализа высших структур нуклеиновых кислот, а также поддерживает исследования механизмов, связанных с заболеваниями G4, и разработку целевых лекарств.

техника нанопоров; G-квадруплексы; однокристальный сенсор; различение топологии; альфа-гемолизин