DNAバーコードとローリングサークル増幅信号増幅戦略によるプロテインキナーゼA電気化学センサーの構築

YANG Qing-di ,  

LI Rong ,  

YANG Jin-ju ,  

ZHANG Yan-li ,  

MEN Xue ,  

WANG Hong-bin ,  

YANG Wen-rong ,  

PANG Peng-fei ,  

摘要

プロテインキナーゼA(PKA)はさまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たし、細胞シグナル、細胞増殖、分化、アポトーシスを調節します。したがって、PKA活性の監視と抑制は医学診断および薬物開発において重要な意義を持ちます。本論文では、DNAバーコード(DNA barcode)とローリングサークル増幅(RCA)信号増幅戦略に基づく電気化学センサープラットフォームを構築し、PKA活性の分析および阻害剤のスクリーニングを実現しました。金ナノケージ/二硫化モリブデン(AuNCs/MoS2)複合材料を電極修飾材料として使用し、ペプチド基質鎖は金—硫黄結合を介して修飾電極(AuNCs/MoS2/GCE)表面に自己組織化され、PKA誘導下で末端リン酸化が起こり、DNAバーコード標識金ナノ粒子(DNA barcode-AuNPs)と高い特異的結合を示します。T4 DNAリガーゼの作用により、DNA barcode-AuNPs中のDNA鎖は環状テンプレートDNA鎖とハイブリダイズしてロックプローブを形成し、phi29 DNAポリメラーゼとdNTPを加えるとRCA反応が誘導されます。RCA産物はヘミン(Hemin)と結合し、G-四重鎖-ヘミン触媒活性を模倣する酵素を形成して電気化学応答信号の増幅およびPKA活性の分析を実現します。この電気化学センサープラットフォームのPKA活性分析における線形応答範囲は0.005〜100 U/mLであり、検出限界(LOD)は1 mU/mLです。本手法はPKA阻害剤のスクリーニングおよびヒト乳がん細胞(MCF-7)や肝がん細胞(HepG-2)ライセート中のPKA活性の分析に利用でき、キナーゼ活性分析に対する新たな方法を提供します。

关键词

DNAバーコード;ローリングサークル増幅;プロテインキナーゼ;リン酸化;電気化学センサー

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