Das Einzelzell-Transkriptomsequenzieren (scRNA-seq) bietet eine beispiellose Auflösung zur Darstellung der zellulären Heterogenität. Traditionelle scRNA-seq-Methoden haben jedoch hohe Zellverluste, Mehrfachzell-Kontaminationen (Doublets) und hohe Kosten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelte diese Arbeit die Well-Multi-seq-Methode. Durch die Kombination eines geschachtelten Mikroporenchips mit Größenausschluss und quasistatischer Fluideinfangtechnik sowie einer mit Cholesterin modifizierten Oligonukleotid-Markierungsstrategie wurde eine hohe Zellerfassungsrate, geringe Kontamination und niedrige Kosten für die multiplexe Probenmisch-Einzelzell-Transkriptomsequenzierung erreicht. Mithilfe des geschachtelten Mikroporenchips wurde die Poisson-Verteilungsgrenze überwunden und eine Mikroperlenbesetzung von bis zu 94 %, eine Zellbesetzung von 74 % und eine Zellerfassungsrate von 87 % erzielt, was die Nutzung von Zellen und Mikrokammern signifikant verbesserte. Durch die stabile Einbettung des Cholesterinmoleküls in die Zellmembran wurden Oligonukleotidketten mit Probenkodierungen an der Zelloberfläche verankert, was eine Mischsequenzierung mehrerer Proben in einem einzigen Röhrchen ermöglichte. Diese Strategie senkt nicht nur die Reagenzienkosten erheblich und vereinfacht den experimentellen Ablauf, sondern ermöglicht auch die Identifikation und Entfernung von Mehrfachzellkontaminationen in der Bibliothek. Bei der Mischsequenzierung von menschlichen und Maus-Zelllinien erreichte die Probenkennzeichnungsgenauigkeit dieser Methode 92,60 % (Mensch) und 95,28 % (Maus), was die hervorragende Markierungsspezifität belegt. Dank der vielfältigen Vorteile von Well-Multi-seq bietet die Methode ein potenzielles Anwendungspotenzial für seltene Zelltypen wie zirkulierende Tumorzellen, Mikronadel-Biopsieproben sowie die Analyse dynamischer Prozesse wie Wirkstoffscreening und Embryonalentwicklung und könnte ein leistungsfähiges Instrument für Grundlagenforschung und klinische Diagnostik werden.

Einzelzellsequenzierung;Mikrofluidikchip;Mehrfach-Probenmarkierung;Cholesterin-modifizierte Marker