Es wurde eine Methode zur kooperativen Amplifikation basierend auf der isothermen nukleinsäure-strangverdrängenden Amplifikationsreaktion (ISDA) und dem CRISPR-Cas12a-System zur Nachweis von microRNA-31 (miRNA-31) entwickelt, bei der ein rückwärts fluoreszenzverstärkter Teststreifen (rLFTS) als Signalplattform zur visuellen Detektion eingesetzt wird. Durch die Optimierung des Primerdesigns für die ISDA-Reaktion und des Reaktionspuffers wurde eine spezifische Erkennung von miRNA-31 und eine erste Signalverstärkung erreicht, wodurch Doppelstrang-DNA produziert wird, die die trans-katalytische Spaltaktivität von CRISPR-Cas12a auf freie einzelsträngige DNA (ssDNA)-Berichtsmoleküle aktiviert. Gleichzeitig wird die Bindung von Goldnanopartikelsonden durch Bildung einer Sandwichstruktur mit der Cy5-Fluoreszenzsonde auf der Testlinie behindert, wodurch die Cy5-Fluoreszenz wiederhergestellt wird. Dies dient als quantitatives Signal und ermöglicht einen hochempfindlichen und hochspezifischen Nachweis von miRNA-31. Die Nachweisgrenze in Speichelproben liegt bei 57,9 amol/L, mit einer Wiederfindungsrate von 91,6 % bis 111 %, und die Nachweisergebnisse stimmen gut mit quantitativen inversen Transkriptions-PCR-Ergebnissen (qRT-PCR) überein. Die Nachweiszeit beträgt nur 90 Minuten. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Methode einfach zu bedienen, hochsensitiv und zeitsparend ist und den Anforderungen einer ultrasensitiven miRNA-31-Nachweismethode in Speichelproben gerecht wird.

Isotherme Strangverdrängungsamplifikation;CRISPR-Cas12a;rückwärts fluoreszenzverstärkter Teststreifen;MiRNA-31;Nukleinsäuren-Nachweis