Ein spezifisches, markierungsfreies Thiol-modifiziertes Aptamer für Chloramphenicol (CAP) wurde mittels Au-S-Bindung auf der Oberfläche einer Gold-Elektrode fixiert, wodurch ein elektrochemischer Aptamer-Sensor zur schnellen, effizienten, sensitiven und spezifischen Detektion von CAP entwickelt wurde. Die Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit des hergestellten Sensors wurden mittels elektrochemischer Impedanzspektroskopie (EIS) untersucht, und es wurden Experimente mit Zugabe in einer Milchmatrix durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die EIS-Reaktion des Sensors auf CAP im Bereich von 1 bis 100 ng/mL eine gute lineare Beziehung aufwies, die Nachweisgrenze (LOD) betrug 0,95 ng/mL; die Reaktionen auf Florfenicol (FFC), Sulfadimidin (SDZ) und Gentamicin (GEN) waren deutlich niedriger als bei CAP, was eine hohe Selektivität zeigt. Zusätzlich lag der EIS-Wert nach 14 Tagen noch bei 90,06 % des Anfangssignals; die relative Standardabweichung (RSD) von fünf Elektroden, die unter gleichen Bedingungen hergestellt wurden, betrug 3,7 %, was eine gute Reproduzierbarkeit und Stabilität zeigt. Die Wiederfindungsrate in der Milchmatrix lag bei 95,8 % bis 111 %, wobei die RSD nicht mehr als 5,6 % betrug. Diese Methode eignet sich für die sensitive Detektion von Chloramphenicol und kann technische Unterstützung und theoretische Grundlagen für den Nachweis von Chloramphenicol in tierischen Lebensmitteln bieten.