Isothermal Strand Displacement Amplification Reaction/CRISPR-Cas12a System for Detection of MicroRNA-31 in Saliva Samples by Combining with Reverse Fluorescence Enhancement Lateral Flow Test Strip

WANG Jia-xun; XU Yi; ZHAO Shuang; GONG Xiao-qun

doi:10.12452/j.fxcsxb.25011324

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Isothermal Strand Displacement Amplification Reaction/CRISPR-Cas12a System for Detection of MicroRNA-31 in Saliva Samples by Combining with Reverse Fluorescence Enhancement Lateral Flow Test Strip

Scientific Papers | 更新时间：2025-11-05

- Isothermal Strand Displacement Amplification Reaction/CRISPR-Cas12a System for Detection of MicroRNA-31 in Saliva Samples by Combining with Reverse Fluorescence Enhancement Lateral Flow Test Strip
- Journal of Instrumental Analysis Vol. 44, Issue 11, Pages: 2346-2353(2025)
- 作者机构：
  
  天津大学医学部生命科学学院，天津 300072
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.12452/j.fxcsxb.25011324
  CLC： O657.3;O629.7
- Received：13 January 2025，
  
  Revised：2025-02-17，
  
  Accepted：17 March 2025，
  
  Published：15 November 2025
- 稿件说明：
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王佳讯,徐一,赵爽,宫晓群.等温链置换扩增反应/CRISPR-Cas12a系统结合反向荧光增强试纸条检测唾液中microRNA-31的研究[J].分析测试学报,2025,44(11):2346-2353.

WANG Jia-xun,XU Yi,ZHAO Shuang,GONG Xiao-qun.Isothermal Strand Displacement Amplification Reaction/CRISPR-Cas12a System for Detection of MicroRNA-31 in Saliva Samples by Combining with Reverse Fluorescence Enhancement Lateral Flow Test Strip[J].Journal of Instrumental Analysis,2025,44(11):2346-2353.
王佳讯,徐一,赵爽,宫晓群.等温链置换扩增反应/CRISPR-Cas12a系统结合反向荧光增强试纸条检测唾液中microRNA-31的研究[J].分析测试学报,2025,44(11):2346-2353. DOI： 10.12452/j.fxcsxb.25011324.

WANG Jia-xun,XU Yi,ZHAO Shuang,GONG Xiao-qun.Isothermal Strand Displacement Amplification Reaction/CRISPR-Cas12a System for Detection of MicroRNA-31 in Saliva Samples by Combining with Reverse Fluorescence Enhancement Lateral Flow Test Strip[J].Journal of Instrumental Analysis,2025,44(11):2346-2353. DOI： 10.12452/j.fxcsxb.25011324.

摘要

构建了基于核酸等温链置换扩增反应（ISDA）及CRISPR-Cas12a系统协同放大检测microRNA-31（miRNA-31）的方法，以反向荧光增强试纸条（rLFTS）为信号展示平台，实现可视化检测。通过优化ISDA反应的引物序列设计及反应缓冲液，实现了miRNA-31特异性识别和第一次信号放大，输出双链DNA产物并激活CRISPR-Cas12a切割游离单链DNA（ssDNA）报告分子的反式切割活性，同时阻碍金纳米探针通过结合ssDNA与检测线上的Cy5荧光探针形成夹心结构，进而恢复Cy5荧光，以此作为定量信号，实现了对miRNA-31的高灵敏和高特异性检测。该方法对唾液样本中miRNA-31的检出限低至57.9 amol/L，加标回收率为91.6%~111%，检测结果与定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）定量结果具有良好的一致性，且检测时间仅需90 min。实验结果表明该方法具有操作简单、灵敏度高、检测时间短等优点，能够满足对唾液样本中miRNA-31的超灵敏检测需求。

Abstract

A microRNA-31（miRNA-31） amplifying detection signals method based on nucleic acid isothermal strand displacement amplification（ISDA） and CRISPR-Cas12a system were established and achieved visualizing detection by combining with reverse fluorescence enhancement lateral flow strip（rLFTS） platform. Under optimizing the primer toehold design and reaction buffer of ISDA reaction，miRNA-31 signal was efficiently amplified to output copious double stranded DNA，which activated CRISPR-Cas12a trans-cleavage activity to digest single-stranded reporter molecules and led to gold nanoparticles couldn′t be captured on the test lines by sandwich method to quench Cy5 fluorescence，causing corresponding quantitative fluorescence signals for improving miRNA-31 detection sensitivity. The results showed that the detection limit of 57.9 amol/L and recoveries of 91.6%-111% for detection miRNA-31 in saliva samples by the method. Moreover，the quantitative results had good consistency with qRT-PCR method in a much faster detection time（90 min）. Given its simplicity，sensitivity and rapid，ISDA-Cas12a-rLFTS could meet the demand for ultra-sensitive detection of miRNA-31 in saliva samples.

关键词

Keywords

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